Về mặt bản chất, hybridization probe là một sợi đơn oligonucleotide (có chiều dài từ 30 đến 100 nucleotide) nên có khả năng tạo liên kết hydro với những đoạn DNA có trình tự bổ sung với HP. Tính đặc trưng của HP phụ thuộc vào trình tự nucleotide của nó, thông thường được kiểm tra bằng cách BLAST trình tự này trên genebank. Nhiệt độ biến tính (Tm) của HP phụ thuộc số lượng và thành phần purin và pyrimidine của HP từ đó quyết định nhiệt độ lai thích hợp trong các thí nghiệm lai phân tử.